von jan » 23.08.2007, 22:07
Hallo Gudrun,
beide Methoden, normale Zytogenetik (Chromosomenanalyse) und FISH haben ihre Vor- und Nachteile.
Im Grunde kannst Du es Dir wie folgt vorstellen: Bei der Zytogenetik wird eine Anzahl lebender, teilungsfähiger Zelle aus dem Knochenmark benötigt. Diese werden weiterverarbeitet, indem man z.B. Material aus dem Knochenmark über 24-48 Stunden im Reagenzglas aufbereitet, dann ein Zellgift hinzugibt, das die Zellen in einer bestimmten Zellteilungsphase "anhält", dann die Probe mit Zentrifugen weiter behandelt, dann die Flüssigkeit auf einen Glasträger auftropft, dann mit dem Mikroskop einen Chromosomenhaufen sucht, diesen abfotografiert, und dann diesen unsortierten Haufen von Chromosomen am Computer weitgehend von Hand nach der Größe sortiert. Dies gibt den sogenannten "Karyotyp", d.h. eine Art "Karte" mit den 46 Chromosomen.
Zur Illustration hier ein Bild der unsortierten Chromosomen einer CML-Zelle, die dann manuell in die richtige Reihenfolge gebracht werden müssen (Quelle: MLL):
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="
http://www.leukaemie-online.de/images/metaphasen.gif"><!-- BBCode End -->
Und noch ein Bild nach einer Sortierung, bei dem man die für CML typische Veränderung an Chromosom 9 und 22 sehen kann:
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="
http://www.leukaemie-online.de/images/karyotyp.gif"><!-- BBCode End -->
Aus der Beschreibung kannst Du schließen, wie aufwändig das ist (dauert insgesamt 4-5 Tage und sehr viel manuelle Arbeit) und warum man deshalb üblicherweise nur 20-25 Zellen untersucht. Der Vorteil ist aber, dass man alle 46 Chromosomen ansieht und so auch genetische Veränderungen an anderen Chromosomen als 9 und 22 (den für CML typischen) entdecken kann. So gibt es z.B. eine Verdreifachung von Chromosom 8 (Trisomie 8 ), die für die Therapiewahl wichtig sein kann - diese sieht man nur in der Zytogenetik, nicht bei FISH und nicht bei PCR.
FISH hingegen ist insofern schneller und einfacher, weil auch nicht mehr teilungsfähiges Zellmaterial untersucht werden kann, dass das Material nicht im Reagenzglas lange angesetzt werden muß, dass die Chromosomen nicht manuell sortiert werden müssen, und dass das Ergebnis so in wenigen Stunden vorliegen kann. Im Grunde funktioniert es so, dass man den Zellhaufen Farbstoffe ("Sonden") zugibt, wovon sich eine Farbe an die Genabfolge BCR, eine andere an die Genabfolge ABL festhängt. In CML-freien Zellen hinge dann die eine Farbe an Chromosom 9, die andere an Chromosom 22. Liegt aber das Philadelphia-Chromosom vor, sind die Farben direkt nebeneinander an einem DNA-Strang, ein Fleck mit zwei verschiedenen Farben zeigt sich.
Siehe folgendes Bild:
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="
http://www.leukaemie-online.de/images/fish.jpg"><!-- BBCode End -->
(FISH-Analyse: 1 rotes Signal (Chromosom 9), 1 grünes Signal (Chromosom 22) und 2 rot-grüne Fusionssignale der Philadelphia-Translokation. Letztere würden bei einer gesunden Zelle fehlen.)
Man kann also bei FISH auf dem Glas-Objektträger unter dem Mikroskop an den zweifarbigen Flecken sehr einfach erkennen, ob das Philadelphia-Chromosom in einer Zelle vorliegt oder nicht, und kann ohne lange Kultivierung und Sortierung relativ schnell rund 200 einzelne Zellen untersuchen (aber trotzdem - obiges muss bei 200 einzelnen Zellhaufen passieren, d.h. es ist auch personalintensiv, v.a. wegen der Fluoreszenzfarbstoffe für die Laboranten recht anstrengend in der Dunkelkammer). Der Nachteil von FISH ist aber - man erkennt nur die Genveränderungen, für die spezifische Farbsonden zugegeben wurden, in dem Fall BCR-ABL - keine zusätzlichen Veränderungen.
FISH wird üblicherweise nicht statt einer PCR verwendet, sondern in bestimmten Situationen hat jede Methode ihre Vorteile. FISH hat eine viel geringere Genauigkeit als PCR, weil man nur eine dreistellige Zellzahl untersucht, während die PCR vereinfacht gesagt aus über 100.000 bis 1 Mio Zellen eine einzige mit BCR-ABL erkennen kann. Man kann also mit der PCR bei sehr weit zurückgedrängter CML (guter molekularer Remission) noch bestimmen, wie hoch die geringe Resterkrankung ist, während bei FISH bei rund 200 untersuchten Zellen vermutlich längst nichts mehr gefunden würde... Bei noch hoher Tumorlast ist FISH aber meist ausreichend...
Ich hoffe, das trägt etwas zum Verständnis bei...
Viele Grüße
Jan
Hallo Gudrun,
beide Methoden, normale Zytogenetik (Chromosomenanalyse) und FISH haben ihre Vor- und Nachteile.
Im Grunde kannst Du es Dir wie folgt vorstellen: Bei der Zytogenetik wird eine Anzahl lebender, teilungsfähiger Zelle aus dem Knochenmark benötigt. Diese werden weiterverarbeitet, indem man z.B. Material aus dem Knochenmark über 24-48 Stunden im Reagenzglas aufbereitet, dann ein Zellgift hinzugibt, das die Zellen in einer bestimmten Zellteilungsphase "anhält", dann die Probe mit Zentrifugen weiter behandelt, dann die Flüssigkeit auf einen Glasträger auftropft, dann mit dem Mikroskop einen Chromosomenhaufen sucht, diesen abfotografiert, und dann diesen unsortierten Haufen von Chromosomen am Computer weitgehend von Hand nach der Größe sortiert. Dies gibt den sogenannten "Karyotyp", d.h. eine Art "Karte" mit den 46 Chromosomen.
Zur Illustration hier ein Bild der unsortierten Chromosomen einer CML-Zelle, die dann manuell in die richtige Reihenfolge gebracht werden müssen (Quelle: MLL):
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="http://www.leukaemie-online.de/images/metaphasen.gif"><!-- BBCode End -->
Und noch ein Bild nach einer Sortierung, bei dem man die für CML typische Veränderung an Chromosom 9 und 22 sehen kann:
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="http://www.leukaemie-online.de/images/karyotyp.gif"><!-- BBCode End -->
Aus der Beschreibung kannst Du schließen, wie aufwändig das ist (dauert insgesamt 4-5 Tage und sehr viel manuelle Arbeit) und warum man deshalb üblicherweise nur 20-25 Zellen untersucht. Der Vorteil ist aber, dass man alle 46 Chromosomen ansieht und so auch genetische Veränderungen an anderen Chromosomen als 9 und 22 (den für CML typischen) entdecken kann. So gibt es z.B. eine Verdreifachung von Chromosom 8 (Trisomie 8 ), die für die Therapiewahl wichtig sein kann - diese sieht man nur in der Zytogenetik, nicht bei FISH und nicht bei PCR.
FISH hingegen ist insofern schneller und einfacher, weil auch nicht mehr teilungsfähiges Zellmaterial untersucht werden kann, dass das Material nicht im Reagenzglas lange angesetzt werden muß, dass die Chromosomen nicht manuell sortiert werden müssen, und dass das Ergebnis so in wenigen Stunden vorliegen kann. Im Grunde funktioniert es so, dass man den Zellhaufen Farbstoffe ("Sonden") zugibt, wovon sich eine Farbe an die Genabfolge BCR, eine andere an die Genabfolge ABL festhängt. In CML-freien Zellen hinge dann die eine Farbe an Chromosom 9, die andere an Chromosom 22. Liegt aber das Philadelphia-Chromosom vor, sind die Farben direkt nebeneinander an einem DNA-Strang, ein Fleck mit zwei verschiedenen Farben zeigt sich.
Siehe folgendes Bild:
<!-- BBCode Start --><IMG SRC="http://www.leukaemie-online.de/images/fish.jpg"><!-- BBCode End -->
(FISH-Analyse: 1 rotes Signal (Chromosom 9), 1 grünes Signal (Chromosom 22) und 2 rot-grüne Fusionssignale der Philadelphia-Translokation. Letztere würden bei einer gesunden Zelle fehlen.)
Man kann also bei FISH auf dem Glas-Objektträger unter dem Mikroskop an den zweifarbigen Flecken sehr einfach erkennen, ob das Philadelphia-Chromosom in einer Zelle vorliegt oder nicht, und kann ohne lange Kultivierung und Sortierung relativ schnell rund 200 einzelne Zellen untersuchen (aber trotzdem - obiges muss bei 200 einzelnen Zellhaufen passieren, d.h. es ist auch personalintensiv, v.a. wegen der Fluoreszenzfarbstoffe für die Laboranten recht anstrengend in der Dunkelkammer). Der Nachteil von FISH ist aber - man erkennt nur die Genveränderungen, für die spezifische Farbsonden zugegeben wurden, in dem Fall BCR-ABL - keine zusätzlichen Veränderungen.
FISH wird üblicherweise nicht statt einer PCR verwendet, sondern in bestimmten Situationen hat jede Methode ihre Vorteile. FISH hat eine viel geringere Genauigkeit als PCR, weil man nur eine dreistellige Zellzahl untersucht, während die PCR vereinfacht gesagt aus über 100.000 bis 1 Mio Zellen eine einzige mit BCR-ABL erkennen kann. Man kann also mit der PCR bei sehr weit zurückgedrängter CML (guter molekularer Remission) noch bestimmen, wie hoch die geringe Resterkrankung ist, während bei FISH bei rund 200 untersuchten Zellen vermutlich längst nichts mehr gefunden würde... Bei noch hoher Tumorlast ist FISH aber meist ausreichend...
Ich hoffe, das trägt etwas zum Verständnis bei...
Viele Grüße
Jan
