Krebs ist das Resultat einer Serie von Veränderungen der Erbsubstanz (Gene/Chromosomen). Diese Veränderungen werden von der anfangs betroffenen Vorläuferzelle an die Tochterzellen weitergegeben, die einen Tumor bilden. Die durch Genveränderungen hervorgerufene abnormale Funktion führt letztlich zum unkontrollierten Wachstum.

Die genaue Diagnose dient dazu festzustellen, ob überhaupt eine Leukämie vorliegt. Falls diese Erkrankung festgestellt wird, kann oft erst durch die Komplikation unterschiedlicher Untersuchungen die genaue Art der Leukämie diagnostiziert werden. Die Untersuchungen sollten von einem darauf spezialisierten Arzt durchgeführt werden.

Wenn aufgrund der Krankheitsgeschichte und der körperlichen Untersuchungen Hinweise auf eine Leukämie bestehen, wird zunächst eine Blutuntersuchung durchgeführt. Dabei wird in einem sogenannten Blutbild die mengenmäßige Zusammensetzung des Blutes bzw. seiner festen Bestandteile überprüft. Das Blutbild eines Patienten wird dabei mit Mittelwerten von Menschen in allen Altersklassen verglichen (vgl. "normales Blutbild"). Wenn die Zellzahl höher oder niedriger ist als dieser Mittelwert, muss eine Ursache für diese Abweichung gesucht werden.

Bestätigt sich bei der Blutuntersuchung der Verdacht z.B. bei Vorhandensein unreifer Blasten und/oder Anämie (Blutarmut), Thrombopenie (Verminderung von Thrombozyten bzw. Blutplättchen), Leukozytose oder Leukopenie (Vermehrung oder Verminderung der Leukozyten bzw. weissen Blutkörperchen, wird der Arzt eine Knochenmarkentnahme (Biopsie) durchführen.

Die Knochenmark-Biopsie kann am Beckenknochen oder am Brustbein durchgeführt werden. Mit den dabei entnommenen Zellen werden im Labor verschiedene Spezialuntersuchungen durchgeführt, die sich für die einzelnen Leukämieformen unterscheiden können. Die Untersuchungen werden durchführt, um die Diagnose einer Leukämie zu sichern und Merkmale festzustellen, die Auswirkungen auf die Behandlung und die Heilungschancen haben können.

Morphologie und Zytochemie

Für diese Untersuchung wird eine Probe des Knochenmarks auf einem Objektträger ausgestrichen und mit Spezialfarbstoffen gefärbt. Dieser Ausstrich wird dann mikroskopisch untersucht und die Zellen werden im Hinblick auf ihr Aussehen und ihre Anzahl beurteilt.

Zytogenetik

Bei der Zytogenetik werden Veränderungen von Chromosomen in normalen und krankhaften Zellen mit mikroskopischen Methoden untersucht. Auf diese Weise können Chromosomenanomalien (z.B. Mutationen oder Gen-Rearrangements) nachgewiesen werden.

Am häufigsten ist hierbei ein Austausch von Material zwischen zwei Chromosomen. Dies wird als Translokation bezeichnet. In der Abkürzung werden die beiden Chromosomen angegeben zwischen denen Material ausgetauscht wurde z.B. t(9;22) als Austausch zwischen den Chromosomen 9 und 22.

Molekulargenetische Techniken bei der CML

Bei der Molekulargenetik wird gezielt nach mikroskopisch nicht erkennbaren Veränderungen der Gene (Erbmaterial) gesucht. Diese Genveränderungen sind meist mit den bereits erwähnten Chromosomenveränderungen verbunden.

Bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML) gelang erstmals mit Hilfe molekulargenetischer Techniken der Nachweis einer tumorspezifischen Chromosomenveränderung in Form des "Philadelphia-Chromosoms" BCR-ABL. Dabei konnte z.B. gezeigt werden, daß die Verkürzung des Chromosoms 22 durch eine Translokation zwischen dem langen Arm von Chromosom 9 und dem langen Arm von Chromosom 22 zustande kommt. Hierbei entstehen auf molekularer Ebene zwei leukämie-spezifische hybride Gene: BCR-ABL auf dem Chromosom 22 und ABL-BCR auf dem Chromosom 9.

Zu den moderneren Methoden, die auf dem molekularbiologischen Nachweis des BCR-ABL- Gens basieren und die auf ca. 95% der CML-Patienten anwendbar sind, zählen die Floureszenz- in-situ-Hybridisierung (FISH), der Western-blot, der Southern-Blot und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für diese Techniken genügt Blut aus der Vene (peripheres Blut) als Untersuchungsmaterial.

Zytogenetik

Mittels der Zytogenetik, der klassischen Chromosomenanalyse, werden in der Regel 25 Zellen in einer bestimmten Phase der Zellteilung (der Metaphase) ausgewertet. Hierbei können mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen Chromosomen-Anomalien nachgewiesen werden.

FISH (Fluoreszenz In Situ Hybridisierung)

Bei der FISH-Untersuchung (Fluoreszenz In Situ Hybridisierung) ist je nach Art der verwendeten Sonden der Nachweis von einer BCR-ABL-positiven Zelle unter 100 bzw. 1.000 Zellen möglich.

Mit Hilfe der FISH können bestimmte Chromosomenabschnitte mit Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Dazu wird die DNA zunächst in zwei Einzelstränge geteilt ("Denaturierung"). Dann können sich spezifische DNA-Sonden, die mit einem Hapten markiert sind, an die Einzelstränge anlagern ("Hybridisierung"). Die hybridisierten Sonden werden über immunzytochemische Verfahren mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern, die an die Haptene binden können, sichtbar gemacht (Detektion). Im Mikroskop können dann die entsprechenden Signale im Zellkern ausgewertet werden, wobei in normalen Zellen immer zwei Signale erwartet werden (außer X oder Y Chromosom bei Männern). Die sogenannte Hypermetaphasen-FISH-Methode, wurde eingeführt, um einerseits weiterhin Metaphasen auszuwerten und andererseits durch Auswertung mittels FISH eine Erhöhung der Genauigkeit zu erreichen.

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

Gegenüber der konventionellen zytogenetischen Analyse läßt sich mittels der PCR eine vielfach gesteigerte Genauigkeit erreichen, da hier ein BCR/ABL-Gen-Rearrangement in 100.000 bis 1.000.000 Zellen nachgewiesen werden kann. Somit dient die PCR u.a. dazu, bei entsprechendem Behandlungserfolg (kompletter zytogenetischer Remission) die minimale Resterkrankung festzustellen. Dies wird durch die millionenfache Vermehrung der rekombinierten BCR/ABL-Region des Philadelphia-Chromosoms im Verlauf der PCR-Reaktion ermöglicht. Zum Nachweis des BCR/ABL-Gen-Rearrangements wird zunächst die RNA aus den Leukozyten des Probenmaterials isoliert, enzymatisch in komplementäre cDNA umgeschrieben, und anschließend unter Verwendung von sequenzspezifischen BCR-und ABL-Oligonukleotiden als Startermolekülen (Primer) in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen (nested PCR) selektiv vervielfältigt. Auf diese Weise können Zellen mit einem BCR/ABL-Genrearrangement im Verhältnis von 1:100.000 bis 1:1.000.000 nachgewiesen werden. Zusätzliche Chromosomenanomalien (z.B. Mutationen), die im Krankheitsverlauf auftreten können, sind durch die PCR allerdings nicht nachzuweisen.

Vergleich der Methoden

Paralleluntersuchungen an 350 CML-Patienten mit klassischer Chromosomenanalyse, Interphase-, Hypermetaphasen-FISH und quantitativer PCR zeigen eine sehr gute Korrelation der Ergebnisse aller vier Methoden. Da die verschiedenen Methoden unterschiedliche Vor- und Nachteile aufweisen, wird sich in Zukunft wahrscheinlich ein gestaffeltes Konzept durchsetzen, welches in den unterschiedlichen Phasen der Erkrankung und unter den verschiedenen Therapiemodalitäten, die jeweils informativste und effektivste Methode verwendet. Von Experten wird jedoch empfohlen, auch bei Erreichen eines sehr geringen Levels der Resterkrankung (molekulare Remission) nicht auf die Zytogenetik zu verzichten und nur z.B. auf die PCR zu setzen, da nur in der Zytogenetik neu entstehende Mutationen bzw. klonale Veränderungen auch ausserhalb des Philadelphia-Chromosoms erkannt werden können.

Charakteristika der Techniken zum Nachweis des Philadelphia-Chromosoms/BCR-ABL:

Methode	Nachweisgrenze	besonderer Vorteil	besonderer Nachteil
Zytogenetik		klonale Evolution erkennbar	nur Knochenmark, ungenau
FISH	1-5% BCR-ABL	semi-quantitiv	falsch-Positive
Southern Blot	1-5% BCR-ABL	semi-quantitiv
Western Blot	0,5-1% BCR-ABL	semi-quantitiv
nested RT-PCR	>0,001% BCR-ABL	sehr sensitiv	nicht quantitiv, falsch-Positive
real-time RT-PCR	0,001% BCR-ABL	quantitiv, hohe Präzision

(Quelle der Tabelle: Oncoscreen.de)