von Alan » 05.12.2022, 17:23
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Kinase-tote BTK-Mutationen verleihen Resistenz gegen kovalente und nichtkovalente BTK-Inhibitoren, sind aber anfällig für BTK-Degrader im klinischen StadiumKlinisch relevantes Abstract-
Trotz hervorragender Ergebnisse für CLL-Patienten, die mit kovalenten BTK-Inhibitoren behandelt werden, erwerben viele Patienten letztendlich eine Resistenz aufgrund von Cystein-481-Mutationen in BTK. Nicht-kovalente BTK-Inhibitoren wie Pirtobrutinib sind gegen C481-Mutationen aktiv, aber anfällig für andere BTK-Mutationen (einschließlich L528W-, V416L-, M437R- und T474I-Mutationen), von denen die meisten auch eine Resistenz gegen kovalente BTK-Inhibitoren verleihen.
Obwohl BTK-Resistenzmutationen die Arzneimittelbindung behindern, machen wir hier die überraschende Beobachtung, dass Arzneimittelresistenzsubstitutionen bei L528W, M437R und V416L die enzymatische Aktivität von BTK deaktivieren und dennoch die Signalisierung von B-Zell-Rezeptoren (BCR) ermöglichen, was auf eine nichtenzymatische oder Gerüstaktivität hindeutet. In-vitro-Kinase-Assays von Wildtyp-BTK in voller Länge und 8 verschiedenen BTK-mutierten Proteinen zeigten, dass BTK C481R, C481F, L528W und V416L nahezu keine Kinaseaktivität aufweisen (Abbildung). Während BTK C481R/F-Mutationen kürzlich als Kinase-tot erwiesen wurden, sind diese mutierten Proteine immer noch von der Phosphorylierung von PLCγ2 Y1217, dem nachgeschalteten Substrat von aktiviertem BTK, abhängig. Im Gegensatz dazu fördern BTK L528W-, M437R- und V416L-Mutationen die BCR-Signalisierung unabhängig von der PLCγ2 Y1217-Phosphorylierung. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führte die Expression von L528W-, M437R- und V416L-Mutationen in BTK-Knockout-DT40-Zellen nicht zu einer BTK Y223-Autophosphorylierung oder Phosphorylierung von PLCγ2.
Trotz der oben genannten Ergebnisse verstärkten BTK-Kinase-tote Mutanten die Signalisierung stromabwärts von BCR nach IgM-Stimulation mit intakter Aktivierung von AKT, ERK und hyperaktivierter Kalziumfreisetzung. Einzelzell-Transkriptomanalysen von BTK-Inhibitor-resistenten CLL-Zellen zeigten eine Hochregulierung der BCR-Transkriptionssignaturen, NFκB und IKZF2/3-Zielgene.
Um zu verstehen, wie Kinase-tote BTK-Mutanten die BCR-Signalisierung verbessern, führten wir globale Phosphoproteomik-, Kinobead-Assays und BTK-Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Studien in BTK-abhängigen menschlichen B-Zell-Lymphomzellen durch, die WT oder Kinase-totes BTK L528W exprimieren. Insgesamt zeigten diese Studien eine einzigartige physikalische Wechselwirkung von BTK L528W mit LYN und HCK sowie die Aktivierung dieser Kinasen und ihrer phosphorylierten Substrate im Vergleich zu WT BTK. Dies deutet darauf hin, dass PLCγ2-unabhängige BTK-Kinase-tote Mutanten BTK/PLCγ2 umgehen, um die BCR-Signalisierung über eine Gerüstfunktion des mutierten BTK zu aktivieren.
Um den Mangel an enzymatischer Aktivität in diesen mutierten BTK-Proteinen zu beheben, untersuchten wir Möglichkeiten, BTK zu eliminieren, anstatt es enzymatisch zu hemmen. Wir erzeugten NX-2127, ein potentes, heterobifunktionelles, oral bioverfügbares Degrader-Molekül, das sowohl BTK- als auch IKZF-Proteine in die Nähe des E3-Ligase-Adapterproteins Cereblon bringt und deren Ubiquitylierung und anschließenden Abbau auslöst. Wichtig ist, dass NX-2127 eine komplexe Bildung von CRBN und WT BTK sowie BTK C481S und T474I Mutanten induzierte, wie durch einen FRET-basierten biochemischen Assay gezeigt wurde. Tatsächlich gebundene NX-2127 WT und den Gatekeeper BTK T474I Mutanten mit ähnlicher Bindungsaffinität. In Übereinstimmung damit förderte NX-2127 den dosisabhängigen Abbau von WT BTK und jeder wiederkehrenden arzneimittelresistenten Mutante (BTK C481S, L528W, V416L, T474I und M437R). Darüber hinaus blockierte der Abbau von WT- und BTK-Mutanten die IgM-abhängige Stimulation der BCR-Signalisierung.
Die oben genannten Ergebnisse motivierten eine erste Phase-1-Studie am Menschen mit NX-2127 bei rezidivierenden/refraktären malignen B-Zell-Erkrankungen (NCT04830137). Ein exemplarischer CLL-Patient mit BTK C481R-Mutation, der unter Ibrutinib und Venetoclax fortgeschritten war, wurde dann mit Pirtobrutinib behandelt und entwickelte eine BTK L528W-Mutation. Die Behandlung mit NX-2127 normalisierte das Blutbild und unterdrückte sowohl BTK C481R- als auch L528W-mutierte Klone, die mit dem Abbau von >90% BTK und IKZF1 in CD19B-Zellen zusammenfielen (Abbildung).+
Diese Ergebnisse decken eine bisher nicht erkannte Funktion von arzneimittelresistenten BTK-Proteinen auf, die BTK enzymatisch tot machen, aber die Fähigkeit behalten, die BCR-Signalisierung über Gerüstfunktionen zu stimulieren, die PLCγ2 umgehen. Wichtig ist, dass jede der rezidivierenden BTK-Mutationen, die bei klinischer Resistenz gegen kovalente und nichtkovalente BTK-Inhibitoren auftreten, anfällig für die hier beschriebene neu entdeckte BTK-Degrader-Verbindung in klinischer Qualität ist, die derzeit in Phase 1b Dosiserweiterung bei CLL mit oder ohne BTK-Mutationen getestet wird.
Gruß Alan
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Kinase-tote BTK-Mutationen verleihen Resistenz gegen kovalente und nichtkovalente BTK-Inhibitoren, sind aber anfällig für BTK-Degrader im klinischen StadiumKlinisch relevantes Abstract-
Trotz hervorragender Ergebnisse für CLL-Patienten, die mit kovalenten BTK-Inhibitoren behandelt werden, erwerben viele Patienten letztendlich eine Resistenz aufgrund von Cystein-481-Mutationen in BTK. Nicht-kovalente BTK-Inhibitoren wie Pirtobrutinib sind gegen C481-Mutationen aktiv, aber anfällig für andere BTK-Mutationen (einschließlich L528W-, V416L-, M437R- und T474I-Mutationen), von denen die meisten auch eine Resistenz gegen kovalente BTK-Inhibitoren verleihen.
Obwohl BTK-Resistenzmutationen die Arzneimittelbindung behindern, machen wir hier die überraschende Beobachtung, dass Arzneimittelresistenzsubstitutionen bei L528W, M437R und V416L die enzymatische Aktivität von BTK deaktivieren und dennoch die Signalisierung von B-Zell-Rezeptoren (BCR) ermöglichen, was auf eine nichtenzymatische oder Gerüstaktivität hindeutet. In-vitro-Kinase-Assays von Wildtyp-BTK in voller Länge und 8 verschiedenen BTK-mutierten Proteinen zeigten, dass BTK C481R, C481F, L528W und V416L nahezu keine Kinaseaktivität aufweisen (Abbildung). Während BTK C481R/F-Mutationen kürzlich als Kinase-tot erwiesen wurden, sind diese mutierten Proteine immer noch von der Phosphorylierung von PLCγ2 Y1217, dem nachgeschalteten Substrat von aktiviertem BTK, abhängig. Im Gegensatz dazu fördern BTK L528W-, M437R- und V416L-Mutationen die BCR-Signalisierung unabhängig von der PLCγ2 Y1217-Phosphorylierung. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führte die Expression von L528W-, M437R- und V416L-Mutationen in BTK-Knockout-DT40-Zellen nicht zu einer BTK Y223-Autophosphorylierung oder Phosphorylierung von PLCγ2.
Trotz der oben genannten Ergebnisse verstärkten BTK-Kinase-tote Mutanten die Signalisierung stromabwärts von BCR nach IgM-Stimulation mit intakter Aktivierung von AKT, ERK und hyperaktivierter Kalziumfreisetzung. Einzelzell-Transkriptomanalysen von BTK-Inhibitor-resistenten CLL-Zellen zeigten eine Hochregulierung der BCR-Transkriptionssignaturen, NFκB und IKZF2/3-Zielgene.
Um zu verstehen, wie Kinase-tote BTK-Mutanten die BCR-Signalisierung verbessern, führten wir globale Phosphoproteomik-, Kinobead-Assays und BTK-Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Studien in BTK-abhängigen menschlichen B-Zell-Lymphomzellen durch, die WT oder Kinase-totes BTK L528W exprimieren. Insgesamt zeigten diese Studien eine einzigartige physikalische Wechselwirkung von BTK L528W mit LYN und HCK sowie die Aktivierung dieser Kinasen und ihrer phosphorylierten Substrate im Vergleich zu WT BTK. Dies deutet darauf hin, dass PLCγ2-unabhängige BTK-Kinase-tote Mutanten BTK/PLCγ2 umgehen, um die BCR-Signalisierung über eine Gerüstfunktion des mutierten BTK zu aktivieren.
Um den Mangel an enzymatischer Aktivität in diesen mutierten BTK-Proteinen zu beheben, untersuchten wir Möglichkeiten, BTK zu eliminieren, anstatt es enzymatisch zu hemmen. Wir erzeugten NX-2127, ein potentes, heterobifunktionelles, oral bioverfügbares Degrader-Molekül, das sowohl BTK- als auch IKZF-Proteine in die Nähe des E3-Ligase-Adapterproteins Cereblon bringt und deren Ubiquitylierung und anschließenden Abbau auslöst. Wichtig ist, dass NX-2127 eine komplexe Bildung von CRBN und WT BTK sowie BTK C481S und T474I Mutanten induzierte, wie durch einen FRET-basierten biochemischen Assay gezeigt wurde. Tatsächlich gebundene NX-2127 WT und den Gatekeeper BTK T474I Mutanten mit ähnlicher Bindungsaffinität. In Übereinstimmung damit förderte NX-2127 den dosisabhängigen Abbau von WT BTK und jeder wiederkehrenden arzneimittelresistenten Mutante (BTK C481S, L528W, V416L, T474I und M437R). Darüber hinaus blockierte der Abbau von WT- und BTK-Mutanten die IgM-abhängige Stimulation der BCR-Signalisierung.
Die oben genannten Ergebnisse motivierten eine erste Phase-1-Studie am Menschen mit NX-2127 bei rezidivierenden/refraktären malignen B-Zell-Erkrankungen (NCT04830137). Ein exemplarischer CLL-Patient mit BTK C481R-Mutation, der unter Ibrutinib und Venetoclax fortgeschritten war, wurde dann mit Pirtobrutinib behandelt und entwickelte eine BTK L528W-Mutation. Die Behandlung mit NX-2127 normalisierte das Blutbild und unterdrückte sowohl BTK C481R- als auch L528W-mutierte Klone, die mit dem Abbau von >90% BTK und IKZF1 in CD19B-Zellen zusammenfielen (Abbildung).+
Diese Ergebnisse decken eine bisher nicht erkannte Funktion von arzneimittelresistenten BTK-Proteinen auf, die BTK enzymatisch tot machen, aber die Fähigkeit behalten, die BCR-Signalisierung über Gerüstfunktionen zu stimulieren, die PLCγ2 umgehen. Wichtig ist, dass jede der rezidivierenden BTK-Mutationen, die bei klinischer Resistenz gegen kovalente und nichtkovalente BTK-Inhibitoren auftreten, anfällig für die hier beschriebene neu entdeckte BTK-Degrader-Verbindung in klinischer Qualität ist, die derzeit in Phase 1b Dosiserweiterung bei CLL mit oder ohne BTK-Mutationen getestet wird.
Gruß Alan